Миозин оор чынжырынан тышкары адамдын скелет булчуң талчаларынын гетерогендүүлүгү

nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, браузердин акыркы версиясын колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, бул сайт стилдерден жана JavaScriptтен эркин болот.
Скелет булчуңу – бул негизинен миофибриллдерден турган гетерогендик ткань, алар адамдарда адатта үч түргө бөлүнөт: бири "жай" (1-тип) жана экөө "тез" (2А жана 2X типтери). Бирок, салттуу миофибрилл түрлөрүнүн ортосундагы жана ичиндеги гетерогендүүлүк азырынча начар изилденген. Биз адамдын vastus lateralis сөөгүнөн алынган 1050 жана 1038 жеке миофибриллдерге транскриптомикалык жана протеомикалык ыкмаларды колдондук. Протеомикалык изилдөөгө эркектер, ал эми транскриптомикалык изилдөөгө 10 эркек жана 2 аял катышкан. Миозиндин оор чынжыр изоформаларынан тышкары, биз көп өлчөмдүү интермиофибрилл өзгөрмөлүүлүгүнүн булактары катары зат алмашуу белокторун, рибосомалык белокторду жана клеткалык байланыш белокторун аныктадык. Андан тышкары, жай жана тез булалардын кластерлерин аныктоого карабастан, биздин маалыматтар 2X типтеги булаларды башка тез тартылуучу булалардан фенотиптик жактан айырмалоого мүмкүн эместигин көрсөтүп турат. Андан тышкары, миозиндин оор чынжырына негизделген классификация немалин миопатияларындагы миофибрилл фенотипин сүрөттөө үчүн жетишсиз. Жалпысынан алганда, биздин маалыматтар миофиберлердин көп өлчөмдүү гетерогендүүлүгүн көрсөтүп турат, вариация булактары миозиндин оор чынжыр изоформаларынан тышкары да созулат.
Клетканын гетерогендүүлүгү бардык биологиялык системалардын ажырагыс өзгөчөлүгү болуп саналат, бул клеткалардын ткандардын жана клеткалардын ар кандай муктаждыктарын канааттандыруу үчүн адистешүүсүнө мүмкүндүк берет.1 Скелет булчуң талчаларынын гетерогендүүлүгү жөнүндөгү салттуу көз караш кыймылдаткыч нейрондор кыймылдаткыч бирдиктин ичиндеги була түрүн аныктайт жана була түрү (б.а., адамдарда 1-тип, 2А-тип жана 2X-тип) миозиндин оор чынжырынын (MYH) изоформаларынын мүнөздөмөлөрү менен аныкталат деген көз карашта болгон.2 Бул башында алардын рН АТФаза туруксуздугуна,3,4 жана кийинчерээк MYH молекулярдык экспрессиясына негизделген.5 Бирок, ар кандай пропорцияларда бир нече MYHди биргелешип экспрессиялаган "аралаш" булаларды аныктоо жана андан кийин кабыл алуу менен, скелет булчуң талчалары өзүнчө була түрлөрү катары эмес, континуум катары каралууда.6 Ошого карабастан, бул тармак дагы эле миофибер классификациясынын негизги классификатору катары MYHге таянат, бул көз карашка, кыязы, MYH экспрессиясынын профилдери жана була түрлөрүнүн диапазону адамдардагыдан айырмаланган алгачкы кемирүүчүлөрдү изилдөөлөрдүн чектөөлөрү жана олуттуу бир жактуулуктары таасир эткен.2 Кырдаал ар кандай адамдын скелет булчуңдары була түрлөрүнүн ар түрдүүлүгүн көрсөтөөрү менен ого бетер татаалдашат.7 vastus lateralis – бул MYH экспрессиясынын орточо (жана ошондуктан репрезентативдик) профилине ээ аралаш булчуң.7 Андан тышкары, үлгү алуунун оңойлугу аны адамдардагы эң жакшы изилденген булчуңга айлантат.
Ошентип, күчтүү "омика" куралдарын колдонуу менен скелет булчуң талчаларынын ар түрдүүлүгүн калыс изилдөө өтө маанилүү, бирок ошол эле учурда кыйын, бул жарым-жартылай скелет булчуң талчаларынын көп ядролуу мүнөзүнө байланыштуу. Бирок, транскриптомика8,9 жана протеомика10 технологиялары акыркы жылдары ар кандай технологиялык жетишкендиктердин аркасында сезгичтикте революцияга учурады, бул скелет булчуңдарын бир булалуу чечилиште талдоого мүмкүндүк берет. Натыйжада, бир булалуу ар түрдүүлүктү жана алардын атрофиялык стимулдарга жана картаюуга болгон реакциясын мүнөздөөдө олуттуу ийгиликтерге жетишилди11,12,13,14,15,16,17,18. Маанилүүсү, бул технологиялык жетишкендиктер клиникалык колдонулушка ээ, бул ооруга байланыштуу дисрегуляцияны кененирээк жана так мүнөздөөгө мүмкүндүк берет. Мисалы, эң кеңири таралган тукум куума булчуң ооруларынын бири болгон немалин миопатиясынын патофизиологиясы (MIM 605355 жана MIM 161800) татаал жана чаташкан.19,20 Ошондуктан, скелет булчуң талчаларынын дисрегуляциясын жакшыраак мүнөздөө бул ооруну түшүнүүбүздө олуттуу жетишкендиктерге алып келиши мүмкүн.
Биз адамдын биопсия үлгүлөрүнөн кол менен бөлүнүп алынган бир скелет булчуң талчаларынын транскриптомикалык жана протеомикалык анализинин ыкмаларын иштеп чыгып, аларды миңдеген талчаларга колдондук, бул бизге адамдын скелет булчуң талчаларынын клеткалык гетерогендүүлүгүн изилдөөгө мүмкүндүк берди. Бул иштин жүрүшүндө биз булчуң талчаларынын транскриптомикалык жана протеомикалык фенотиптештирүүсүнүн күчүн көрсөттүк жана зат алмашуу, рибосомалык жана клеткалык байланыш белокторун талчалар аралык өзгөрмөлүүлүктүн маанилүү булактары катары аныктадык. Андан тышкары, бул протеомикалык жумуш агымын колдонуп, биз бир скелет булчуң талчаларындагы нематод миопатиясынын клиникалык маанисин мүнөздөдүк, MYH негизинде талчанын түрүнө көз карандысыз кычкылданбаган талчаларга координацияланган жылыш бар экенин көрсөттүк.
Адамдын скелет булчуң талчаларынын гетерогендүүлүгүн изилдөө үчүн, биз бир скелет булчуң талчаларынын транскриптом жана протеом анализин жүргүзүүгө мүмкүндүк берүүчү эки жумуш агымын иштеп чыктык (1А-сүрөт жана кошумча 1А-сүрөт). Биз үлгүнү сактоодон жана РНК менен белоктун бүтүндүгүн сактоодон баштап, ар бир ыкма үчүн өткөрүү жөндөмдүүлүгүн оптималдаштырууга чейинки бир нече методологиялык кадамдарды иштеп чыгып, оптималдаштырдык. Транскриптом анализи үчүн бул тескери транскрипциянын баштапкы этабында үлгүгө мүнөздүү молекулярдык штрих-коддорду киргизүү менен жетишилди, бул натыйжалуу кийинки иштетүү үчүн 96 буланы бириктирүүгө мүмкүндүк берди. Салттуу бир клеткалуу ыкмаларга салыштырмалуу тереңирээк секвенирлөө (бир булага ±1 миллион окуу) транскриптом маалыматтарын ого бетер байытты.21 Протеомика үчүн биз жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгүн сактоо менен протеомдун тереңдигин оптималдаштыруу үчүн timsTOF массалык спектрометринде DIA-PASEF маалыматтарын алуу менен айкалышкан кыска хроматографиялык градиентти (21 мүнөт) колдондук. 22,23 Дени сак скелет булчуң талчаларынын гетерогендүүлүгүн изилдөө үчүн, биз 14 дени сак чоң киши донорунун 1050 жеке талчасынын транскриптомдорун жана 5 дени сак чоң киши донорунун 1038 талчасынын протеомдорун мүнөздөдүк (1-кошумча таблица). Бул макалада бул маалыматтар топтому тиешелүүлүгүнө жараша 1000 талчалуу транскриптомдор жана протеомдор деп аталат. Биздин ыкма 1000 талчалуу транскриптомдук жана протеомдук анализдерде жалпысынан 27 237 транскриптти жана 2983 белокту аныктады (1А-сүрөт, 1–2-кошумча маалыматтар топтому). Транскриптомдук жана протеомдук маалыматтар топтомдорун >1000 аныкталган гендер жана ар бир талча үчүн 50% жарактуу маанилер үчүн чыпкалагандан кийин, андан кийинки биоинформатикалык анализдер тиешелүүлүгүнө жараша транскриптомдогу жана протеомдогу 925 жана 974 талча үчүн жүргүзүлдү. Фильтрациядан кийин, ар бир буладан орточо эсеп менен 4257 ± 1557 ген жана 2015 ± 234 белок (орточо ± SD) аныкталган, жеке адамдар арасындагы өзгөрмөлүүлүк чектелүү болгон (1B–C кошумча сүрөттөрү, 3–4 кошумча маалыматтар топтому). Бирок, субъекттин ичиндеги өзгөрмөлүүлүк катышуучулардын арасында көбүрөөк байкалган, бул, кыязы, ар кандай узундуктагы жана кесилиш аянтындагы булалардын ортосундагы РНК/белоктун түшүмдүүлүгүндөгү айырмачылыктардан улам болгон. Көпчүлүк белоктор үчүн (>2000), вариация коэффициенти 20% дан төмөн болгон (1D кошумча сүрөт). Эки ыкма тең булчуңдардын жыйрылышы үчүн маанилүү болгон жогорку экспрессияланган белгилери бар транскрипттердин жана белоктордун кеңири динамикалык диапазонун алууга мүмкүндүк берген (мисалы, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (1E–F кошумча сүрөттөрү). Аныкталган белгилердин көпчүлүгү транскриптомикалык жана протеомикалык маалымат топтомдорунун ортосунда жалпы болгон (1G кошумча сүрөт) жана бул белгилердин орточо UMI/LFQ интенсивдүүлүгү жакшы корреляцияланган (r = 0,52) (1H кошумча сүрөт).
Транскриптомика жана протеомика жумуш агымы (BioRender.com менен түзүлгөн). BD MYH7, MYH2 жана MYH1 үчүн динамикалык диапазон ийри сызыктары жана була түрүн дайындоо үчүн эсептелген босоголор. E, F Транскриптомика жана протеомика маалымат топтомдорундагы булалар боюнча MYH экспрессиясынын бөлүштүрүлүшү. G, H MYH негизиндеги була түрү боюнча түстүү транскриптомика жана протеомика үчүн бирдиктүү ар түрдүүлүктү жакындаштыруу жана проекциялоо (UMAP) графиктери. I, J Транскриптомика жана протеомика маалымат топтомдорундагы MYH7, MYH2 жана MYH1 экспрессиясын көрсөткөн өзгөчөлүк графиктери.
Башында биз ар бир булага MYH негизиндеги була түрүн omics маалымат топтомдорундагы MYH экспрессиясынын жогорку сезгичтигин жана динамикалык диапазонун пайдалануучу оптималдаштырылган ыкманы колдонуу менен дайындоону чечтик. Мурунку изилдөөлөр булаларды таза 1-тип, 2A-тип, 2X-тип же ар кандай MYH экспрессиясынын белгиленген пайызына негизделген аралаш деп белгилөө үчүн каалаган босоголорду колдонгон11,14,24. Биз ар бир буланын экспрессиясы булаларды терүү үчүн колдонгон MYHтер боюнча рейтингге ээ болгон башка ыкманы колдондук: MYH7, MYH2 жана MYH1, тиешелүүлүгүнө жараша 1-тип, 2A-тип жана 2X-типтеги булаларга туура келет. Андан кийин биз ар бир пайда болгон ийри сызыктын төмөнкү ийри чекитин математикалык жактан эсептеп, аны ар бир MYH үчүн булаларды оң (босогодон жогору) же терс (босогодон төмөн) катары дайындоо үчүн босого катары колдондук (1B–D-сүрөт). Бул маалыматтар MYH7 (1B-сүрөт) жана MYH2 (1C-сүрөт) белок деңгээлине салыштырмалуу РНК деңгээлинде ачык/айкын экспрессия профилдерине ээ экенин көрсөтүп турат. Чынында эле, белок деңгээлинде өтө аз гана булалар MYH7 экспрессиялаган эмес жана бир дагы була 100% MYH2 экспрессиясына ээ болгон эмес. Андан кийин биз ар бир маалымат топтомундагы бардык булаларга MYH негизиндеги була түрлөрүн дайындоо үчүн алдын ала аныкталган экспрессия босоголорун колдондук. Мисалы, MYH7+/MYH2-/MYH1- булалары 1-типке, ал эми MYH7-/MYH2+/MYH1+ булалары аралаш 2A/2X тибине дайындалган (толук сүрөттөмө үчүн 2-кошумча таблицаны караңыз). Бардык булаларды бириктирип, биз MYH негизиндеги була түрлөрүнүн РНК (1E сүрөт) жана белок (1F сүрөт) деңгээлдеринде укмуштуудай окшош бөлүштүрүлүшүн байкадык, ал эми MYH негизиндеги була түрлөрүнүн салыштырмалуу курамы күтүлгөндөй эле ар бир адамда ар кандай болгон (2A кошумча сүрөт). Көпчүлүк булалар таза 1-тип (34–35%) же 2A тип (36–38%) катары классификацияланган, бирок аралаш 2A/2X типтеги булалардын да бир топ саны аныкталган (16–19%). Таң калыштуу айырмачылык, таза типтеги 2X жипчелери РНК деңгээлинде гана аныкталышы мүмкүн, бирок белок деңгээлинде эмес, бул MYHтин тез экспрессиясы транскрипциядан кийин жок дегенде жарым-жартылай жөнгө салынаарын көрсөтүп турат.
Биз протеомикага негизделген MYH буласын типтөө ыкмабызды антитело негизиндеги чекиттүү блоттоону колдонуу менен текшердик жана эки ыкма тең таза 1-типтеги жана 2А типтеги булаларды аныктоодо 100% дал келүүгө жетишти (кошумча 2B сүрөтүн караңыз). Бирок, протеомикага негизделген ыкма аралаш булаларды аныктоодо жана ар бир буладагы ар бир MYH генинин үлүшүн сандык жактан аныктоодо сезгичирээк, натыйжалуураак болгон. Бул маалыматтар скелет булчуң булаларынын түрлөрүн мүнөздөө үчүн объективдүү, өтө сезгич омикага негизделген ыкманы колдонуунун натыйжалуулугун көрсөтөт.
Андан кийин биз транскриптомика жана протеомика тарабынан берилген айкалышкан маалыматты колдонуп, миофиберлерди алардын толук транскриптомуна же протеомуна жараша объективдүү түрдө классификацияладык. Өлчөмдүүлүктү алты негизги компонентке чейин азайтуу үчүн бирдиктүү көп кырдуу жакындаштыруу жана проекциялоо (UMAP) ыкмасын колдонуп (3A–B кошумча сүрөттөр), биз транскриптомдогу (1G-сүрөт) жана протеомдогу (1H-сүрөт) миофиберлердин өзгөрмөлүүлүгүн көрсөтө алдык. Белгилей кетчү нерсе, миофиберлер транскриптомика же протеомика маалыматтар топтомунда катышуучулар (3C–D кошумча сүрөттөрү) же сыноо күндөрү (3E кошумча сүрөт) боюнча топтоштурулган эмес, бул скелет булчуң талчаларынын субъект ичиндеги өзгөрмөлүүлүгү субъекттер ортосундагы өзгөрмөлүүлүккө караганда жогору экенин көрсөтүп турат. UMAP графигинде "тез" жана "жай" миофиберлерди билдирген эки башка кластер пайда болду (1G–H сүрөттөрү). MYH7+ (жай) миофиберлери UMAP1дин оң уюлунда топтолгон, ал эми MYH2+ жана MYH1+ (тез) миофиберлери UMAP1дин терс уюлунда топтолгон (1I–J сүрөттөр). Бирок, MYH экспрессиясына негизделген тез ийилүүчү була түрлөрүнүн (б.а., 2A түрү, 2X түрү же аралаш 2A/2X) ортосунда эч кандай айырмачылык көрсөтүлгөн эмес, бул MYH1 (1I–J сүрөт) же ACTN3 же MYLK2 (кошумча 4A–B сүрөттөр) сыяктуу башка классикалык 2X миофибер маркерлеринин экспрессиясы бүтүндөй транскриптомду же протеомду карап жатканда ар кандай миофибер түрлөрүнүн ортосунда айырмачылыкты көрсөтпөй тургандыгын көрсөтүп турат. Андан тышкары, MYH2 жана MYH7 менен салыштырганда, бир нече транскрипттер же белоктор MYH1 менен оң корреляцияланган (кошумча 4C–H сүрөттөрү), бул MYH1дин көптүгү миофибер транскриптомун/протеомун толук чагылдырбай тургандыгын көрсөтүп турат. Үч MYH изоформасынын аралаш экспрессиясын UMAP деңгээлинде баалоодо ушул сыяктуу тыянактарга жетишилген (4I–J кошумча сүрөттөр). Ошентип, 2X жипчелерин MYH сандык аныктоосунун негизинде гана транскрипт деңгээлинде аныктоого болот, ал эми MYH1+ жипчелери бүтүндөй транскриптомду же протеомду карап жатканда башка тез жипчелерден айырмаланбайт.
MYHден тышкары жай була гетерогендүүлүгүн алгачкы изилдөө катары, биз төрт белгиленген жай була түрүнө мүнөздүү белокторду бааладык: TPM3, TNNT1, MYL3 жана ATP2A22. Жай була түрчөлөрү транскриптомикада (5A кошумча сүрөт) жана протеомикада (5B кошумча сүрөт) MYH7 менен Пирсондун жогорку, бирок кемчиликсиз корреляциясын көрсөттү. Жай булалардын болжол менен 25% жана 33% транскриптомикада (5C кошумча сүрөт) жана протеомикада (5D кошумча сүрөт) бардык ген/белок түрчөлөрү боюнча таза жай булалар катары классификацияланган эмес. Ошондуктан, бир нече ген/белок түрчөлөрүнө негизделген жай була классификациясы була түрүнө мүнөздүү деп белгилүү болгон белоктор үчүн да кошумча татаалдыкты жаратат. Бул бир ген/белок үй-бүлөсүнүн изоформаларына негизделген була классификациясы скелет булчуң булаларынын чыныгы гетерогендүүлүгүн жетиштүү деңгээлде чагылдырбашы мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Адамдын скелет булчуң талчаларынын фенотиптик өзгөрмөлүүлүгүн бүтүндөй омика моделинин масштабында андан ары изилдөө үчүн, биз негизги компоненттик анализди (PCA) колдонуу менен маалыматтардын калыс өлчөмдүүлүгүн азайтуу боюнча иш жүргүздүк (2A-сүрөт). UMAP графиктерине окшош, катышуучу да, сыноо күнү да PCA деңгээлинде була кластерлерине таасир эткен жок (6A–C кошумча сүрөттөрү). Эки маалымат топтомунда тең MYH негизиндеги була түрү PC2 менен түшүндүрүлдү, ал жай тартылуучу 1-типтеги булалардын кластерин жана тез тартылуучу 2A, 2X жана аралаш 2A/2X булаларын камтыган экинчи кластерди көрсөттү (2A-сүрөт). Эки маалымат топтомунда тең бул эки кластер аз сандагы аралаш 1/2A булалары менен байланышкан. Күтүлгөндөй, негизги PC драйверлеринин ашыкча көрсөтүлүшүн талдоо PC2 жыйрылуу жана зат алмашуу белгилери менен башкарылаарын тастыктады (2B-сүрөт жана 6D–E кошумча сүрөттөрү, 5–6 кошумча маалыматтар топтому). Жалпысынан алганда, MYH негизиндеги була түрү PC2 боюнча үзгүлтүксүз өзгөрүүлөрдү түшүндүрүү үчүн жетиштүү деп табылган, тез кластердин ичинде транскриптом боюнча бөлүштүрүлгөн 2X булаларынан тышкары.
A. MYH негизинде була түрүнө жараша түстүү транскриптом жана протеом маалыматтар топтомдорунун негизги компоненттик анализинин (PCA) графиктери. B. PC2 жана PC1деги транскрипт жана белок драйверлеринин байытуу анализи. Статистикалык анализ clusterProfiler пакетин жана Бенджамини-Хохбергдин туураланган p-маанилерин колдонуу менен жүргүзүлдү. C, D. Транскриптомдогу клетка аралык адгезия генинин онтологиясы (GO) терминдерине жана протеомдогу костамера GO терминдерине ылайык түстүү PCA графиктери. Жебелер транскрипт жана белок драйверлерин жана алардын багыттарын билдирет. E, F. Жай/тез була түрүнө көз карандысыз экспрессия градиенттерин көрсөткөн клиникалык жактан тиешелүү белгилердин бирдиктүү көп кырдуу жакындаштыруу жана проекциялоо (UMAP) функцияларынын графиктери. G, H. Транскриптомдордогу жана протеомдордогу PC2 жана PC1 драйверлеринин ортосундагы корреляциялар.
Күтүлбөгөн жерден, MYH негизиндеги миофибер түрү өзгөрмөлүүлүктүн экинчи эң жогорку даражасын (PC2) гана түшүндүрдү, бул MYH негизиндеги миофибер түрүнө (PC1) байланышы жок башка биологиялык факторлор скелет булчуң талчаларынын гетерогендүүлүгүн жөнгө салууда маанилүү ролду ойной тургандыгын көрсөтүп турат. PC1деги эң жогорку драйверлердин ашыкча көрсөтүлүшүн талдоо PC1деги өзгөрмөлүүлүк негизинен транскриптомдогу клетка-клетка адгезиясы жана рибосоманын курамы, ошондой эле протеомдогу костюмдар жана рибосомалык белоктор менен аныкталаарын көрсөттү (2B сүрөт жана 6D–E кошумча сүрөттөрү, 7-кошумча маалыматтар топтому). Скелет булчуңунда костюмдар Z-дискти сарколеммага туташтырат жана күчтү өткөрүүгө жана сигнал берүүгө катышат. 25 Клетка-клетка адгезиясын (транскриптом, 2C сүрөт) жана костюмерди (протеом, 2D сүрөт) колдонуу менен жасалган аннотацияланган PCA графиктери PC1де солго күчтүү жылышууну көрсөттү, бул өзгөчөлүктөр белгилүү бир булалар менен байытылганын көрсөтүп турат.
UMAP деңгээлиндеги миофиберлердин кластерленишин кененирээк изилдөө көпчүлүк өзгөчөлүктөр миофибер субкластерине мүнөздүү эмес, миофибердин түрүнө көз карандысыз MYH негизиндеги экспрессия градиентин көрсөтөрүн көрсөттү. Бул үзгүлтүксүздүк CHCHD10 (нерв-булчуң оорусу), SLIT3 (булчуң атрофиясы), CTDNEP1 (булчуң оорусу) сыяктуу патологиялык шарттар менен байланышкан бир нече гендер үчүн байкалган (2E-сүрөт). Бул үзгүлтүксүздүк протеом боюнча да байкалган, анын ичинде неврологиялык бузулуулар (UGDH), инсулин сигнализациясы (PHIP) жана транскрипция (HIST1H2AB) менен байланышкан белоктор (2F-сүрөт). Жалпысынан алганда, бул маалыматтар ар кандай миофиберлерде буланын түрүнө көз карандысыз жай/тез жыйрылуунун гетерогендүүлүгүндөгү үзгүлтүксүздүктү көрсөтөт.
Кызыктуусу, PC2деги драйвер гендери жакшы транскриптом-протеом корреляциясын көрсөттү (r = 0,663) (2G-сүрөт), бул жай жана тез тартылуучу була түрлөрү, атап айтканда, скелет булчуң талчаларынын жыйрылуу жана зат алмашуу касиеттери транскрипциялык жактан жөнгө салынаарын көрсөтүп турат. Бирок, PC1деги драйвер гендери транскриптом-протеом корреляциясын көрсөтпөдү (r = -0,027) (2H-сүрөт), бул жай/тез тартылуучу була түрлөрүнө байланышпаган вариациялар транскрипциядан кийин көбүнчө жөнгө салынаарын көрсөтүп турат. PC1деги вариациялар негизинен рибосомалык ген онтологиясынын терминдери менен түшүндүрүлгөндүктөн жана рибосомалар белокторду которууга активдүү катышуу жана таасир этүү менен клеткада маанилүү жана адистештирилген ролду ойноорун эске алганда,31 биз андан кийин бул күтүлбөгөн рибосомалык гетерогендүүлүктү изилдөөгө кириштик.
Биз алгач протеомиканын негизги компонентинин анализ графигин GOCC "цитоплазмалык рибосома" термининдеги белоктордун салыштырмалуу көптүгүнө жараша боёдук (3A-сүрөт). Бул термин PC1дин оң жагында байытылганы менен, кичинекей градиентке алып келсе да, рибосомалык белоктор PC1дин эки багытында тең бөлүнүүнү шарттайт (3A-сүрөт). PC1дин терс жагында байытылган рибосомалык белокторго RPL18, RPS18 жана RPS13 кирген (3B-сүрөт), ал эми RPL31, RPL35 жана RPL38 (3C-сүрөт) PC1дин оң жагында негизги кыймылдаткычтар болгон. Кызыктуусу, RPL38 жана RPS13 башка ткандарга салыштырмалуу скелет булчуңдарында жогорку деңгээлде экспрессияланган (7A-сүрөт). PC1деги бул өзгөчө рибосомалык кол тамгалар транскриптомдо байкалган эмес (7B-сүрөт), бул транскрипциядан кийинки жөнгө салууну көрсөтүп турат.
A. Протеом боюнча цитоплазмалык рибосомалык ген онтологиясынын (GO) терминдерине ылайык түстүү негизги компоненттик анализдин (PCA) графиги. Жебелер PCA графигиндеги белок аркылуу вариациянын багытын көрсөтөт. Сызыктын узундугу берилген белок үчүн негизги компоненттик упайга туура келет. B, C. PCA RPS13 жана RPL38 үчүн графиктерди камтыйт. D. Цитоплазмалык рибосомалык белоктордун көзөмөлсүз иерархиялык кластердик анализи. E. Скелет булчуң талчаларында ар кандай молчулуктагы рибосомалык белокторду бөлүп көрсөткөн 80S рибосомасынын (PDB: 4V6X) структуралык модели. F. мРНК чыгуу каналынын жанында жайгашкан ар кандай стехиометриясы бар рибосомалык белоктор.
Рибосомалык гетерогендүүлүк жана адистешүү түшүнүктөрү мурда сунушталган, анда рибосомалардын ар кандай субпопуляцияларынын болушу (рибосомалык гетерогендүүлүк) ар кандай ткандардагы белоктордун трансляциясына түздөн-түз таасир этиши мүмкүн32 жана клеткалар33 белгилүү бир мРНК транскрипт пулдарынын34 (рибосомалык адистешүү) тандалма трансляциясы аркылуу. Скелет булчуң талчаларында биргелешип экспрессияланган рибосомалык белоктордун субпопуляцияларын аныктоо үчүн, биз протеомдогу рибосомалык белоктордун көзөмөлсүз иерархиялык кластердик анализин жүргүздүк (3D-сүрөт, Кошумча маалыматтар топтому 8). Күтүлгөндөй, рибосомалык белоктор MYH негизинде буланын түрү боюнча кластерленген эмес. Бирок, биз рибосомалык белоктордун үч башка кластерин аныктадык; биринчи кластер (ribosomal_cluster_1) RPL38 менен биргелешип жөнгө салынат жана ошондуктан оң PC1 профили бар булаларда экспрессиясы жогорулаган. Экинчи кластер (ribosomal_cluster_2) RPS13 менен биргелешип жөнгө салынат жана терс PC1 профили бар булаларда жогорулайт. Үчүнчү кластер (ribosomal_cluster_3) скелет булчуң талчаларында координацияланган дифференциалдык экспрессияны көрсөтпөйт жана аны "өзөк" скелет булчуңунун рибосомалык белогу деп эсептөөгө болот. 1 жана 2-рибосомалык кластерлердин экөө тең мурда альтернативдүү которууну жөнгө салуучу (мисалы, RPL10A, RPL38, RPS19 жана RPS25) жана өнүгүүгө функционалдык таасир этүүчү (мисалы, RPL10A, RPL38) рибосомалык белокторду камтыйт.34,35,36,37,38 PCA жыйынтыктарына ылайык, бул рибосомалык белоктордун талчалар боюнча байкалган гетерогендик көрсөтүлүшү да үзгүлтүксүздүктү көрсөттү (7C кошумча сүрөт).
Рибосоманын ичиндеги гетерогендик рибосомалык белоктордун жайгашкан жерин визуалдаштыруу үчүн биз адамдын 80S рибосомасынын структуралык моделин колдондук (Белок маалыматтар банкы: 4V6X) (3E-сүрөт). Ар кандай рибосомалык кластерлерге таандык рибосомалык белокторду бөлүп алгандан кийин, алардын жайгашкан жери бири-бирине жакын эмес болчу, бул биздин ыкмабыз рибосоманын айрым аймактарын/фракцияларын байытууну камсыз кыла албаганын көрсөтүп турат. Бирок, кызыктуусу, 2-кластердеги чоң суббирдик белоктордун үлүшү 1 жана 3-кластерлерге караганда төмөн болгон (7D-кошумча сүрөт). Биз скелет булчуң талчаларында стехиометриясы өзгөртүлгөн белоктор негизинен рибосоманын бетинде жайгашканын байкадык (3E-сүрөт), бул алардын ар кандай мРНК популяцияларындагы рибосоманын ички кирүү сайтынын (IRES) элементтери менен өз ара аракеттенүү жөндөмүнө дал келет, ошону менен селективдүү которууну координациялайт.40, 41 Андан тышкары, скелет булчуң талчаларында стехиометриясы өзгөртүлгөн көптөгөн белоктор мРНК чыгуу туннели сыяктуу функционалдык аймактардын жанында жайгашкан (3F-сүрөт), алар белгилүү бир пептиддердин трансляциялык узарышын жана токтоп калышын селективдүү түрдө жөнгө салат. 42 Кыскасы, биздин маалыматтар скелет булчуңунун рибосомалык белокторунун стехиометриясы гетерогендүүлүктү көрсөтүп, скелет булчуң талчаларынын ортосунда айырмачылыктарды пайда кыларын көрсөтүп турат.
Андан кийин биз тез жана жай тартылуучу була кол тамгаларын аныктоого жана алардын транскрипциялык жөнгө салуу механизмдерин изилдөөгө кириштик. Эки маалымат топтомунда (1G–H жана 4A–B сүрөттөрү) UMAP тарабынан аныкталган тез жана жай тартылуучу була кластерлерин салыштырып, транскриптомикалык жана протеомикалык анализдер тиешелүү түрдө 1366 жана 804 дифференциалдуу түрдө мол мүнөздөмөлөрдү аныктады (4A–B сүрөттөрү, Кошумча маалымат топтомдору 9–12). Биз саркомерлерге (мисалы, тропомиозин жана тропонин), козголуу-жыйрылуунун байланышына (SERCA изоформалары) жана энергия алмашуусуна (мисалы, ALDOA жана CKB) байланыштуу кол тамгалардагы күтүлгөн айырмачылыктарды байкадык. Андан тышкары, белоктун убиквитиндешин жөнгө салуучу транскрипттер жана белоктор тез жана жай тартылуучу булаларда (мисалы, USP54, SH3RF2, USP28 жана USP48) дифференциалдуу түрдө экспрессияланган (4A–B сүрөттөрү). Мындан тышкары, мурда козунун булчуң талчаларынын түрлөрү боюнча43 дифференциалдуу түрдө экспрессияланаары жана жүрөк булчуңундагы44 SERCA активдүүлүгүн жогорулатары көрсөтүлгөн микробдук белок гени RP11-451G4.2 (DWORF) жай скелет булчуң талчаларында бир кыйла жогорулаган (4А-сүрөт). Ошо сыяктуу эле, жеке була деңгээлинде метаболизмге байланыштуу лактатдегидрогеназа изоформалары (LDHA жана LDHB, 4C-сүрөт жана 8A-кошумча сүрөт)45,46 сыяктуу белгилүү белгилерде, ошондой эле мурда белгисиз болгон була түрүнө мүнөздүү белгилерде (мисалы, IRX3, USP54, USP28 жана DPYSL3) олуттуу айырмачылыктар байкалган (4C-сүрөт). Транскриптомикалык жана протеомикалык маалымат топтомдорунун ортосунда дифференциалдуу түрдө экспрессияланган белгилердин олуттуу дал келүүсү (8B-сүрөт), ошондой эле негизинен саркомер белгилеринин дифференциалдык экспрессиясынын айкыныраак болушу менен шартталган бүктөмдүн өзгөрүшүнүн корреляциясы болгон (8C-сүрөт). Белгилей кетчү нерсе, айрым кол тамгалар (мисалы, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) протеомдук деңгээлде гана транскрипциядан кийинки күчтүү жөнгө салууну көрсөттү жана жай/тез жыйрылуучу буланын түрүнө мүнөздүү экспрессия профилдерине ээ болду (8C кошумча сүрөт).
1G–H сүрөттөрүндөгү бирдиктүү көп кырдуу жакындаштыруу жана проекция (UMAP) графиктери менен аныкталган жай жана ылдам кластерлерди салыштырган А жана В жанар тоо графиктери. Түстүү чекиттер FDR < 0,05 болгондо бир кыйла айырмаланган транскрипттерди же белокторду, ал эми караңгы чекиттер логарифмдик өзгөрүү > 1 болгондо бир кыйла айырмаланган транскрипттерди же белокторду билдирет. Эки тараптуу статистикалык анализ Бенджамини-Хохбергдин туураланган p маанилери (транскриптомика) менен DESeq2 Валд тестин же эмпирикалык Байес анализи менен Лимма сызыктуу моделинин ыкмасын колдонуу менен жүргүзүлдү, андан кийин бир нече салыштыруулар үчүн Бенджамини-Хохбергдин тууралоосу (протеомика) берилди. C Жай жана тез булалардын ортосундагы тандалган дифференциалдуу экспрессияланган гендердин же белоктордун кол графиктери. D Бир кыйла айырмаланган экспрессияланган транскрипттердин жана белоктордун байытуу анализи. Кайчылаш маанилер эки маалымат топтомунда тең байытылган, транскриптом маанилери транскриптомдо гана байытылган, ал эми протеом маанилери протеомдо гана байытылган. Статистикалык анализ Бенджамини-Хохбергдин туураланган p-маанилери менен clusterProfiler пакетин колдонуу менен жүргүзүлдү. E. SCENIC тарабынан аныкталган буланын түрүнө мүнөздүү транскрипция факторлору, SCENICтен алынган жөнгө салуучу спецификалуулук упайларына жана буланын түрлөрүнүн ортосундагы дифференциалдык мРНК экспрессиясына негизделген. F. Жай жана тез булалардын ортосунда дифференциалдуу түрдө экспрессияланган тандалган транскрипция факторлорунун профилин түзүү.
Андан кийин биз ар кандай түрдө көрсөтүлгөн гендер менен белоктордун ашыкча көрсөтүлүшүн талдоо жүргүздүк (4D-сүрөт, Кошумча маалыматтар топтому 13). Эки маалымат топтомунун ортосунда айырмаланган өзгөчөлүктөр үчүн жолду байытуу күтүлгөн айырмачылыктарды көрсөттү, мисалы, май кислотасынын β-кычкылдануусу жана кетон алмашуу процесстери (жай жипчелер), миофиламенттин/булчуңдун жыйрылуу (тиешелүүлүгүнө жараша тез жана жай жипчелер) жана углеводдордун катаболикалык процесстери (тез жипчелер). Серин/треонин протеин фосфатазасынын активдүүлүгү тез жипчелерде да жогорулаган, бул гликоген алмашуусун жөнгө салуучу белгилүү жөнгө салуучу жана каталитикалык фосфатаза суббирдиктери (PPP3CB, PPP1R3D жана PPP1R3A) сыяктуу өзгөчөлүктөр менен шартталган (47) (Кошумча сүрөттөр 8D–E). Тез жипчелерге байытылган башка жолдорго протеомдогу иштетүүчү (P-) денечелер (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (кошумча 8F-сүрөт), транскрипциядан кийинки жөнгө салууга катышышы мүмкүн (48) жана транскриптомдогу транскрипция факторунун активдүүлүгү (SREBF1, RXRG, RORA) кирген (кошумча 8G-сүрөт). Жай жипчелер оксидоредуктаза активдүүлүгү (BDH1, DCXR, TXN2) (кошумча 8H-сүрөт), амид байланышы (CPTP, PFDN2, CRYAB) (кошумча 8I-сүрөт), клеткадан тышкаркы матрица (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (кошумча 8J-сүрөт) жана рецептор-лиганд активдүүлүгү (FNDC5, SPX, NENF) (кошумча 8K-сүрөт).
Жай/тез булчуң талчасынын түрүнүн мүнөздөмөлөрүнүн негизиндеги транскрипциялык жөнгө салууну тереңирээк түшүнүү үчүн, биз SCENIC49 (кошумча маалыматтар топтому 14) колдонуп, транскрипция факторун байытуу анализин жүргүздүк. Көптөгөн транскрипция факторлору тез жана жай булчуң талчаларынын ортосунда бир кыйла байытылган (4E-сүрөт). Буга мурда тез булчуң талчасынын өнүгүшү менен байланышкан MAFA сыяктуу транскрипция факторлору,50 ошондой эле мурда булчуң талчасынын түрүнө мүнөздүү ген программалары менен байланышпаган бир нече транскрипция факторлору кирген. Булардын арасында PITX1, EGR1 жана MYF6 тез булчуң талчаларында эң байытылган транскрипция факторлору болгон (4E-сүрөт). Ал эми ZSCAN30 жана EPAS1 (ошондой эле HIF2A деп аталат) жай булчуң талчаларында эң байытылган транскрипция факторлору болгон (4E-сүрөт). Буга ылайык, MAFA тез булчуң талчаларына туура келген UMAP аймагында жогорку деңгээлде экспрессияланган, ал эми EPAS1 тескери экспрессия үлгүсүнө ээ болгон (4F-сүрөт).
Белгилүү белок коддоочу гендерден тышкары, адамдын өнүгүүсүн жана ооруларын жөнгө салууга катышышы мүмкүн болгон көптөгөн коддолбогон РНК биотиптери бар. 51, 52 Транскриптомдук маалыматтар топтомдорунда бир нече коддолбогон РНКлар була түрүнүн спецификасын көрсөтөт (5А-сүрөт жана Кошумча маалыматтар топтому 15), анын ичинде LINC01405 жай булалар үчүн өтө спецификалдуу жана митохондриялык миопатия менен ооругандардын булчуңдарында азайганы кабарланган. 53 Ал эми, lnc-ERCC5-5 генине туура келген RP11-255P5.3 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, тез була түрүнүн спецификасын көрсөтөт. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) жана RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) экөө тең скелет булчуңунун спецификасын көрсөтөт (9A–B кошумча сүрөттөр) жана алардын 1 Мб геномдук коңшулугунда белгилүү жыйрылуу гендери жок, бул алардын коңшу жыйрылуу гендерин жөнгө салуунун ордуна була түрлөрүн жөнгө салууда адистештирилген ролду ойной тургандыгын көрсөтүп турат. LINC01405 жана RP11-255P5.3 жай/ылдам була түрүнө мүнөздүү экспрессия профилдери тиешелүүлүгүнө жараша RNAscope колдонуу менен тастыкталган (5B–C сүрөттөр).
A. Коддолбогон РНК транскрипттери жай жана тез тартылуучу булчуң талчаларында олуттуу түрдө жөнгө салынат. B. LINC01405 жана RP11-255P5.3 жай жана тез тартылуучу була түрүнүн спецификасын көрсөткөн репрезентативдик РНКоскоп сүрөттөрү. Масштаб тилкеси = 50 мкм. C. RNAscope менен аныкталгандай, миофибердин түрүнө мүнөздүү коддолбогон РНК экспрессиясын сандык аныктоо (көз карандысыз адамдардан алынган n = 3 биопсия, ар бир адамдын ичиндеги тез жана жай булчуң талчаларын салыштыруу). Статистикалык анализ эки куйруктуу Стьюденттин t-тестинин жардамы менен жүргүзүлдү. Кутуча графиктеринде медиана жана биринчи жана үчүнчү квартилдер көрсөтүлгөн, муруттары минималдуу жана максималдуу маанилерди көрсөтүп турат. D. De novo микробдук белокту идентификациялоо жумуш агымы (BioRender.com менен түзүлгөн). E. LINC01405_ORF408:17441:17358 микробдук протеини жай скелет булчуң талчаларында өзгөчө экспрессияланат (көз карандысыз катышуучулардан алынган n=5 биопсия, ар бир катышуучудагы тез жана жай булчуң талчаларын салыштыруу). Статистикалык талдоо Лимм сызыктуу моделинин ыкмасы менен эмпирикалык Байес ыкмасы менен айкалыштырылган, андан кийин Бенджамини-Хохберг ыкмасы менен p-маанисин тууралоо менен көп салыштыруулар жүргүзүлгөн. Кутуча графиктеринде медиана, биринчи жана үчүнчү квартилдер көрсөтүлгөн, муруттары максималдуу/минималдуу маанилерди көрсөтүп турат.
Жакында жүргүзүлгөн изилдөөлөр көрсөткөндөй, көптөгөн болжолдуу коддолбогон транскрипттер транскрипцияланган микробдук белокторду коддойт, алардын айрымдары булчуң функциясын жөнгө салат. 44, 55 Булчуң түрүнө мүнөздүү потенциалдуу микробдук белокторду аныктоо үчүн, биз 1000 булалуу транскриптом маалыматтар топтомунда табылган коддолбогон транскрипттердин ырааттуулугун (n = 305) камтыган FASTA файлын колдонуп, 1000 булалуу протеом маалыматтар топтомун издедик (5D-сүрөт). Биз 22 ар кандай транскрипттен 197 микробдук белокту аныктадык, алардын 71и жай жана тез скелет булчуң талчаларынын ортосунда дифференциалдуу түрдө жөнгө салынган (9C кошумча сүрөт жана 16-кошумча маалыматтар топтому). LINC01405 үчүн үч микробдук белок продуктусу аныкталды, алардын бири транскриптине окшош жай булалуу спецификалуулукту көрсөттү (5E сүрөт жана 9D кошумча сүрөт). Ошентип, биз LINC01405ти жай скелет булчуң талчаларына мүнөздүү микробдук белокту коддогон ген катары аныктадык.
Биз жеке булчуң талчаларынын кеңири масштабдуу протеомикалык мүнөздөмөсү үчүн комплекстүү жумуш агымын иштеп чыктык жана дени сак абалдарда талчалардын гетерогендүүлүгүнүн жөнгө салуучуларын аныктадык. Биз бул жумуш агымын немалин миопатияларынын скелет булчуң талчаларынын гетерогендүүлүгүнө кандай таасир этерин түшүнүү үчүн колдондук. Немалин миопатиялары - булчуңдардын алсыздыгын пайда кылган тукум куума булчуң оорулары жана жабыркаган балдарда дем алуу кыйынчылыгы, сколиоз жана бут-колдун кыймылдуулугунун чектелиши сыяктуу бир катар кыйынчылыктар менен коштолот. 19,20 Адатта, немалин миопатияларында актин альфа 1 (ACTA1) сыяктуу гендердеги патогендик варианттар жай ийилүүчү талчалардын миофибер курамынын басымдуулугуна алып келет, бирок бул таасир гетерогендүү. Бир көрүнүктүү өзгөчөлүк - бул тез талчалардын басымдуулугуна ээ болгон тропонин T1 немалин миопатия (TNNT1). Ошентип, немалин миопатияларында байкалган скелет булчуң талчаларынын дисрегуляциясынын негизинде жаткан гетерогендүүлүктү жакшыраак түшүнүү бул оорулар менен миофибер түрүнүн ортосундагы татаал байланышты чечүүгө жардам берет.
Дени сак контролдук топко салыштырмалуу (топто n=3), ACTA1 жана TNNT1 гендеринде мутациялары бар немалин миопатиясынын бейтаптарынан бөлүнүп алынган миофиберлер миофибердин атрофиясын же дистрофиясын байкашкан (6A-сүрөт, 3-кошумча таблица). Бул жеткиликтүү материалдын чектелүү көлөмүнөн улам протеомдук анализ үчүн олуттуу техникалык кыйынчылыктарды жаратты. Ошого карабастан, биз 272 скелет миофиберинен 2485 белокту аныктай алдык. Ар бир буладан кеминде 1000 сандык белокту чыпкалагандан кийин, 250 була кийинки биоинформатикалык анализге дуушар болду. Чыпкалагандан кийин, ар бир буладан орточо эсеп менен 1573 ± 359 белок сандык түрдө аныкталды (10A-кошумча сүрөт, 17–18-кошумча маалыматтар топтому). Белгилей кетчү нерсе, буланын өлчөмүнүн олуттуу азайышына карабастан, немалин миопатиясынын бейтаптарынын үлгүлөрүнүн протеом тереңдиги бир аз гана азайган. Мындан тышкары, бул маалыматтарды өзүбүздүн FASTA файлдарыбызды (коддолбогон транскрипттерди кошо алганда) колдонуу менен иштетүү бизге немалин миопатиясынын бейтаптарынын скелет миофиберлериндеги беш микробдук белокту аныктоого мүмкүндүк берди (Кошумча маалыматтар топтому 19). Протеомдун динамикалык диапазону бир кыйла кеңири болгон жана контролдук тобундагы жалпы белоктор мурунку 1000 булалуу протеом анализинин жыйынтыктары менен жакшы корреляцияланган (Кошумча 10B–C сүрөт).
A. ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатияларында (NM) була атрофиясын же дистрофиясын жана MYH негизинде ар кандай була түрлөрүнүн басымдуулугун көрсөткөн микроскопиялык сүрөттөр. Масштаб тилкеси = 100 мкм. ACTA1 жана TNNT1 бейтаптарында боёонун кайталанышын камсыз кылуу үчүн, репрезентативдик сүрөттөрдү тандоодон мурун үч бейтаптын биопсиясы эки-үч жолу (ар бир учурда төрт бөлүк) боёлгон. B. MYH негизинде катышуучулардагы була түрүнүн пропорциялары. C. Немалин миопатиялары бар жана контролдук топтордогу бейтаптардагы скелет булчуң талчаларынын негизги компоненттик анализинин (PCA) графиги. D. Немалин миопатиялары бар жана контролдук топтордогу бейтаптардын скелет булчуң талчалары 2-сүрөттө талданган 1000 буладан аныкталган PCA графигине проекцияланган. Мисалы, ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатиялары жана контролдук топторундагы катышуучулардын ортосундагы, ошондой эле ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатиялары бар катышуучулардын ортосундагы айырмачылыктарды салыштырган вулкандык графиктер. Түстүү тегерекчелер π < 0,05 болгондо бир кыйла айырмаланган белокторду, ал эми кара чекиттер FDR < 0,05 болгондо бир кыйла айырмаланган белокторду билдирет. Статистикалык анализ Лимма сызыктуу моделинин ыкмасын жана эмпирикалык Байес ыкмаларын колдонуу менен жүргүзүлдү, андан кийин Бенджамини-Хохберг ыкмасын колдонуу менен бир нече салыштыруулар үчүн p-маанисин тууралоо жүргүзүлдү. H. Бүтүндөй протеом боюнча жана 1 жана 2A типтеги жипчелердеги бир кыйла дифференциалдуу экспрессияланган белокторду байытуу анализи. Статистикалык анализ clusterProfiler пакетин жана Бенджамини-Хохбергдин туураланган p-маанилерин колдонуу менен жүргүзүлдү. I, J. Клеткадан тышкаркы матрица жана митохондриялык ген онтологиясы (GO) терминдери менен боёлгон негизги компоненттик анализдин (PCA) графиктери.
Немалин миопатиялары скелет булчуңдарындагы MYH экспрессиялаган миофибер түрлөрүнүн үлүшүнө таасир этиши мүмкүн болгондуктан,19,20 биз алгач немалин миопатиялары бар бейтаптарда жана контролдук топто MYH экспрессиялаган миофибер түрлөрүн изилдедик. Биз миофибер түрүн мурда 1000 миофибер анализи үчүн сүрөттөлгөн калыс ыкманы колдонуп аныктадык (кошумча сүрөттөр 10D–E) жана кайрадан таза 2X миофиберлерди аныктай алган жокпуз (6B сүрөт). Биз немалин миопатияларынын миофибер түрүнө гетерогендүү таасирин байкадык, анткени ACTA1 мутациясы бар эки бейтапта 1-типтеги миофиберлердин үлүшү жогорулаган, ал эми TNNT1 немалин миопатиясы бар эки бейтапта 1-типтеги миофиберлердин үлүшү азайган (6B сүрөт). Чынында эле, MYH2 жана тез тропонин изоформаларынын (TNNC2, TNNI2 жана TNNT3) экспрессиясы ACTA1-немалин миопатияларында төмөндөгөн, ал эми MYH7 экспрессиясы TNNT1-немалин миопатияларында төмөндөгөн (кошумча 11A сүрөт). Бул немалин миопатияларында гетерогендик миофибер түрүнүн алмашуусу жөнүндөгү мурунку отчетторго дал келет.19,20 Биз бул жыйынтыктарды иммуногистохимия аркылуу тастыктадык жана ACTA1-немалин миопатиясына чалдыккан бейтаптарда 1-типтеги миофиберлер басымдуулук кыларын, ал эми TNNT1-немалин миопатиясына чалдыккан бейтаптарда тескерисинче схема бар экенин аныктадык (6A сүрөт).
Бир булалуу протеом деңгээлинде ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатиясынын бейтаптарынын скелет булчуң талчалары контролдук талчалардын көпчүлүгү менен топтолгон, TNNT1 немалин миопатиясынын талчалары жалпысынан эң катуу жабыркаган (6C-сүрөт). Бул ар бир бейтап үчүн жасалма көбөйтүлгөн талчалардын негизги компоненттик анализинин (PCA) графиктерин түзүүдө өзгөчө байкалган, TNNT1 немалин миопатиясынын 2 жана 3-бейтаптары контролдук үлгүлөрдөн эң алыс жайгашкан (11B кошумча сүрөт, 20-кошумча маалыматтар топтому). Миопатия менен ооругандардын талчаларынын дени сак талчалар менен кандайча салыштырылганын жакшыраак түшүнүү үчүн, биз дени сак чоңдордун 1000 талчасынын протеомикалык анализинен алынган деталдуу маалыматты колдондук. Биз миопатия маалыматтар топтомунан (ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатиясынын бейтаптары жана контролдоо тобу) талчаларды 1000 булалуу протеомикалык анализден алынган PCA графикке проекцияладык (6D-сүрөт). Контролдук булаларда PC2 боюнча MYH була түрлөрүнүн таралышы 1000 булалуу протеомикалык анализден алынган булалардын таралышына окшош болгон. Бирок, немалин миопатиясындагы бейтаптардын көпчүлүк булалары PC2 ылдый жылып, дени сак тез ийилүүчү булалар менен дал келген, алардын MYH буласынын түрүнө карабастан. Ошентип, ACTA1 немалин миопатиясындагы бейтаптар MYH негизиндеги ыкмаларды колдонуу менен сандык жактан аныкталганда 1-типтеги булаларга жылыш көрсөтүшкөнү менен, ACTA1 немалин миопатия жана TNNT1 немалин миопатиялары скелет булчуң буласынын протеомасын тез ийилүүчү булаларга жылдырышкан.
Андан кийин биз ар бир бейтап тобун дени сак контролдук топ менен түздөн-түз салыштырып, ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатияларында тиешелүүлүгүнө жараша 256 жана 552 дифференциалдуу экспрессияланган белокторду аныктадык (6E–G сүрөтү жана 11C кошумча сүрөтү, 21-кошумча маалыматтар топтому). Гендерди байытуу анализи митохондриялык белоктордун координацияланган төмөндөшүн көрсөттү (6H–I сүрөтү, 22-кошумча маалыматтар топтому). Таң калыштуусу, ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатияларында була түрлөрүнүн дифференциалдуу басымдуулук кылышына карабастан, бул төмөндөө MYH негизиндеги була түрүнөн толугу менен көз карандысыз болгон (6H сүрөтү жана 11D–I кошумча сүрөттөрү, 23-кошумча маалыматтар топтому). ACTA1 же TNNT1 немалин миопатияларында үч микробдук белок да жөнгө салынган. Бул микропротеиндердин экөөсү, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 же Lnc-FOXO1 деп да аталат) жана ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), 1-типтеги миофиберлерде гана ар кандай молчулукту көрсөткөн. ENSG00000215483_TR14_ORF67 мурда клетка циклин жөнгө салууда роль ойной турганы кабарланган. 56 Башка жагынан алганда, дени сак контролдук топко салыштырмалуу ACTA1-немалин миопатиясындагы ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798ге туура келет) 1-типтеги жана 2А типтеги миофиберлерде көбөйгөн (Кошумча сүрөт 12A, Кошумча маалыматтар топтому 24). Ал эми, рибосомалык белокторго немалин миопатиясынын таасири чоң болгон эмес, бирок RPS17 ACTA1 немалин миопатиясында төмөндөгөн (6E-сүрөт).
Байытуу анализи ошондой эле ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатияларында иммундук системанын процесстеринин жогорулаганын көрсөттү, ал эми TNNT1 немалин миопатиясында клеткалардын адгезиясы да жогорулаган (6H-сүрөт). Бул клеткадан тышкаркы факторлордун байышы PC1 жана PC2деги PCAны терс багытта (б.а., эң көп жабыркаган жипчелерге карай) жылдырган клеткадан тышкаркы матрица белоктору менен чагылдырылган (6J-сүрөт). Эки бейтаптын тобунда тең иммундук реакцияларга жана сарколеммалык калыбына келтирүү механизмдерине катышкан клеткадан тышкаркы белоктордун, мисалы, аннексиндердин (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 жана алардын өз ара аракеттенүүчү протеини S100A1159 (кошумча сүрөттөр 12B–C). Бул процесс мурда булчуң дистрофияларында күчөгөнү кабарланган60, бирок, биздин билишибизче, мурда немалин миопатиялары менен байланышкан эмес. Бул молекулярдык механизмдин нормалдуу иштеши жаракаттан кийин сарколеммалык калыбына келтирүү жана жаңы пайда болгон миоциттердин миофиберлер менен биригиши үчүн талап кылынат58,61. Ошентип, бул процесстин эки пациенттин тобунда тең активдүүлүгүнүн жогорулашы миофибердин туруксуздугунан улам келип чыккан жаракатка репаративдик жоопту көрсөтүп турат.
Ар бир немалин миопатиясынын таасири жакшы корреляцияланган (r = 0.736) жана акылга сыярлык дал келүүнү көрсөткөн (11A–B кошумча сүрөттөр), бул ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатиясынын протеомго окшош таасири бар экенин көрсөтүп турат. Бирок, кээ бир белоктор ACTA1 же TNNT1 немалин миопатиясында гана жөнгө салынган (11A жана C кошумча сүрөттөр). MFAP4 профибротикалык белогу TNNT1 немалин миопатиясындагы эң жогорулаган белоктордун бири болгон, бирок ACTA1 немалин миопатиясында өзгөрүүсүз калган. HOX ген транскрипциясын жөнгө салууга жооптуу PAF1C комплексинин компоненти болгон SKIC8 TNNT1 немалин миопатиясында төмөндөгөн, бирок ACTA1 немалин миопатиясында жабыркаган эмес (11A кошумча сүрөт). ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатиясын түз салыштыруу TNNT1 немалин миопатиясында митохондриялык белоктордун көбүрөөк азайышын жана иммундук системанын белокторунун көбөйүшүн көрсөттү (6G–H сүрөтү жана 11C жана 11H–I кошумча сүрөттөрү). Бул маалыматтар TNNT1 немалин миопатиясында TNNT1 немалин миопатиясына салыштырмалуу байкалган атрофиянын/дистрофиясынын көбүрөөк болушу менен дал келет (6A сүрөтү), бул TNNT1 немалин миопатиясынын оорунун оор түрүн билдирерин көрсөтүп турат.
Немалин миопатиясынын байкалган таасирлери бүтүндөй булчуң деңгээлинде сакталып калабы же жокпу, баалоо үчүн, биз TNNT1 немалин миопатиясынын ошол эле когортасынан алынган булчуң биопсияларынын жалпы протеомикалык анализин жүргүзүп, аларды контролдук топ менен салыштырдык (ар бир топко n=3) (Кошумча 13A-сүрөт, Кошумча маалыматтар топтому 25). Күтүлгөндөй, контролдук топ негизги компоненттерди анализдөөдө тыгыз байланышта болгон, ал эми TNNT1 немалин миопатиясынын бейтаптары бир була анализинде байкалганга окшош жогорку үлгүлөр аралык өзгөрмөлүүлүктү көрсөтүшкөн (Кошумча 13B-сүрөт). Жалпы анализ жеке булаларды салыштыруу менен белгиленген дифференциалдуу экспрессияланган белокторду (Кошумча 13C-сүрөт, Кошумча маалыматтар топтому 26) жана биологиялык процесстерди (Кошумча 13D-сүрөт, Кошумча маалыматтар топтому 27) кайра чыгарган, бирок ар кандай була түрлөрүн айырмалоо жөндөмүн жоготкон жана булалар боюнча гетерогендик оорунун таасирин эске алган эмес.
Жалпысынан алганда, бул маалыматтар бир миофиберлүү протеомика иммуноблоттинг сыяктуу максаттуу ыкмалар менен аныкталбаган клиникалык биологиялык өзгөчөлүктөрдү аныктай аларын көрсөтүп турат. Андан тышкары, бул маалыматтар фенотиптик адаптацияны сүрөттөө үчүн актин буласын типтештирүүнү (MYH) гана колдонуунун чектөөлөрүн баса белгилейт. Чынында эле, буланын түрүн алмаштыруу актин жана тропонин немалин миопатияларынын ортосунда айырмаланса да, эки немалин миопатия тең MYH буласын типтештирүүнү скелет булчуң буласынын метаболизминен тезирээк жана азыраак кычкылдануучу булчуң протеомуна карай ажыратат.
Клетканын гетерогендүүлүгү ткандардын ар түрдүү талаптарын канааттандыруу үчүн абдан маанилүү. Скелет булчуңдарында бул көбүнчө күч өндүрүүнүн жана чарчоонун ар кандай даражалары менен мүнөздөлгөн була түрлөрү катары сүрөттөлөт. Бирок, бул скелет булчуң буласынын өзгөрмөлүүлүгүнүн бир аз гана бөлүгүн түшүндүрөрү айдан ачык, ал мурда ойлогондон алда канча өзгөрмөлүү, татаал жана көп кырдуу. Технологиялык жетишкендиктер азыр скелет булчуң булаларын жөнгө салуучу факторлорду ачыкка чыгарды. Чынында эле, биздин маалыматтар 2X типтеги булалар скелет булчуң буласынын өзүнчө бир түрчөсү болбошу мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Андан тышкары, биз зат алмашуу белокторун, рибосомалык белокторду жана клетка менен байланышкан белокторду скелет булчуң буласынын гетерогендүүлүгүнүн негизги детерминанттары катары аныктадык. Нематод миопатиясы менен ооруган бейтаптардын үлгүлөрүнө протеомикалык жумуш агымыбызды колдонуу менен, биз MYH негизиндеги була типтештирүү скелет булчуңунун гетерогендүүлүгүн толук чагылдырбай турганын, айрыкча система бузулганда, көрсөттүк. Чынында эле, MYH негизиндеги була түрүнө карабастан, нематод миопатиясы тезирээк жана азыраак кычкылдануучу булаларга өтүүгө алып келет.
Скелет булчуң талчалары 19-кылымдан бери классификацияланып келет. Жакында жүргүзүлгөн омика анализдери бизге ар кандай MYH була түрлөрүнүн экспрессия профилдерин жана алардын ар кандай стимулдарга болгон реакцияларын түшүнүүгө мүмкүндүк берди. Бул жерде сүрөттөлгөндөй, омика ыкмалары скелет булчуң талчасынын түрүн аныктоо үчүн бир (же бир нече) маркердин сандык аныктоосуна таянбастан, салттуу антитело негизиндеги ыкмаларга караганда була түрүнүн маркерлерин сандык аныктоодо жогорку сезгичтикке ээ. Биз кошумча транскриптомикалык жана протеомикалык жумуш агымдарын колдондук жана адамдын скелет булчуң талчаларындагы була гетерогендүүлүгүнүн транскрипциялык жана транскрипциядан кийинки жөнгө салынышын изилдөө үчүн жыйынтыктарды бириктирдик. Бул жумуш агымы дени сак жаш эркектердин когортасындагы vastus lateralisтеги белок деңгээлинде таза 2X типтеги булаларды аныктоодо ийгиликсиздикке алып келди. Бул дени сак vastus lateralisте <1% таза 2X булаларын тапкан мурунку бир була изилдөөлөрүнө дал келет, бирок бул келечекте башка булчуңдарда тастыкталышы керек. мРНК деңгээлинде дээрлик таза 2X булаларын аныктоо менен белок деңгээлинде аралаш 2A/2X булаларын гана аныктоонун ортосундагы айырмачылык таң калыштуу. MYH изоформасынын мРНК экспрессиясы циркаддык эмес,67 бул биздин РНК деңгээлиндеги таза 2X жипчелериндеги MYH2 башталыш сигналын "өткөрүп жибергенибиз" күмөн экенин көрсөтүп турат. Бир мүмкүн болгон түшүндүрмө, таза гипотетикалык болгону менен, MYH изоформаларынын ортосундагы белоктун жана/же мРНКнын туруктуулугундагы айырмачылыктар болушу мүмкүн. Чынында эле, эч кандай тез жипче MYH изоформасы үчүн 100% таза эмес жана MYH1 мРНК экспрессиясынын деңгээли 70–90% диапазондо белок деңгээлинде бирдей MYH1 жана MYH2 молчулугуна алып келеби же жокпу, белгисиз. Бирок, транскриптомду же протеомду толугу менен карап жатканда, кластердик анализ алардын так MYH курамына карабастан, жай жана тез скелет булчуң жипчелерин билдирген эки гана өзүнчө кластерди ишенимдүү түрдө аныктай алат. Бул бир ядролуу транскриптомикалык ыкмаларды колдонгон анализдерге шайкеш келет, алар адатта эки гана өзүнчө мионуклеардык кластерди аныктайт. 68, 69, 70 Андан тышкары, мурунку протеомикалык изилдөөлөр 2X типтеги булаларды аныктаганына карабастан, бул булалар калган тез булалардан өзүнчө топтолбойт жана MYHге негизделген башка була түрлөрүнө салыштырмалуу ар кандай мол белоктордун аз гана санын көрсөтөт. 14 Бул жыйынтыктар биз булчуң булаларынын классификациясынын 20-кылымдын башындагы көз карашына кайтып келишибиз керектигин көрсөтүп турат, ал адамдын скелет булчуң булаларын MYHге негизделген үч башка класска эмес, алардын зат алмашуу жана жыйрылуу касиеттерине жараша эки кластерге бөлгөн. 63
Андан да маанилүүсү, миофиберлердин гетерогендүүлүгүн бир нече өлчөмдөрдө карап чыгуу керек. Мурунку "омика" изилдөөлөрү ушул багытты көрсөтүп, скелет булчуң талчалары дискреттик кластерлерди түзбөй, континуум боюнча жайгашканын көрсөткөн. 11, 13, 14, 64, 71 Бул жерде биз скелет булчуңдарынын жыйрылуу жана зат алмашуу касиеттериндеги айырмачылыктардан тышкары, миофиберлерди клетка-клетка өз ара аракеттенүүсүнө жана трансляция механизмдерине байланыштуу өзгөчөлүктөр менен айырмалоого болорун көрсөтөбүз. Чынында эле, биз скелет булчуң талчаларында рибосомалардын гетерогендүүлүгүн байкадык, ал жай жана тез була түрлөрүнө карабастан гетерогендүүлүккө өбөлгө түзөт. Жай жана тез була түрлөрүнө карабастан, бул олуттуу миофиберлердин гетерогендүүлүгүнүн негизги себеби белгисиз бойдон калууда, бирок ал белгилүү бир күчтөргө жана жүктөмдөргө оптималдуу жооп берген булчуң бөлүкчөлөрүндөгү адистештирилген мейкиндик уюшууну,72 булчуң микрочөйрөсүндөгү башка клетка түрлөрү менен адистештирилген клеткалык же органга мүнөздүү байланышты73,74,75 же жеке миофиберлердин ичиндеги рибосомалардын активдүүлүгүндөгү айырмачылыктарды көрсөтүшү мүмкүн. Чынында эле, рибосомалык гетероплазмия, RPL3 жана RPL3L паралогиялык алмаштыруу аркылуу же рРНКнын 2′O-метилденүү деңгээлинде, скелет булчуңдарынын гипертрофиясы менен байланыштуу экени көрсөтүлгөн76,77. Мультимикалык жана мейкиндиктеги колдонмолор жеке миофибралардын функционалдык мүнөздөмөсү менен айкалышып, булчуң биологиясын көпимикалык деңгээлде түшүнүүбүздү андан ары өркүндөтөт78.
Немалин миопатиялары менен ооруган бейтаптардын жалгыз миофиберлеринин протеомдорун талдоо менен, биз скелет булчуңдарынын клиникалык патофизиологиясын түшүндүрүү үчүн жалгыз миофибер протеомикасынын пайдалуулугун, натыйжалуулугун жана колдонулушун көрсөттүк. Андан тышкары, биздин жумуш агымыбызды глобалдык протеомикалык анализ менен салыштыруу менен, биз жалгыз миофибер протеомикасынын глобалдык ткандардын протеомикасы сыяктуу эле маалымат тереңдигин берерин жана бул тереңдикти булалар аралык гетерогендүүлүктү жана миофибер түрүн эске алуу менен кеңейтерин көрсөтө алдык. ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатияларында дени сак контролдук топко салыштырмалуу була түрүнүн катышындагы күтүлгөн (өзгөрүлмө болсо да) айырмачылыктардан тышкары,19 биз MYH аркылуу була түрүнүн которулушунан көз карандысыз кычкылдануу жана клеткадан тышкаркы ремоделдөөнү да байкадык. Фиброз мурда TNNT1 немалин миопатияларында катталган.19 Бирок, биздин анализ бул ачылышка таянып, ACTA1 жана TNNT1 немалин миопатиялары менен ооругандардын миофиберлеринде сарколеммалык калыбына келтирүү механизмдерине катышкан аннексиндер сыяктуу клеткадан тышкаркы бөлүнүп чыккан стресске байланыштуу белоктордун деңгээлинин жогорулаганын аныктайт.57,58,59 Жыйынтыктап айтканда, немалин миопатиялары менен ооругандардын миофиберлеринде аннексин деңгээлинин жогорулашы катуу атрофиялык миофиберлерди калыбына келтирүүгө клеткалык жоопту билдириши мүмкүн.
Бул изилдөө бүгүнкү күнгө чейин адамдардын бир булалуу бүтүн булчуң-мульскомикасын анализдөөнүн эң ири үлгүсү болгону менен, ал чектөөсүз эмес. Биз катышуучулардын салыштырмалуу кичинекей жана бир тектүү үлгүсүнөн жана бир булчуңдан (vastus lateralis) скелет булчуң талчаларын бөлүп алдык. Ошондуктан, булчуң түрлөрү боюнча жана булчуң физиологиясынын чектен чыккан учурларында белгилүү бир була популяцияларынын бар экендигин жокко чыгаруу мүмкүн эмес. Мисалы, жогорку деңгээлде даярдалган спринтерлерде жана/же күч спортчуларында79 же булчуңдардын кыймылсыздыгы мезгилинде66,80 ультратез булалардын бир бөлүгүнүн (мисалы, таза 2X булалары) пайда болуу мүмкүнчүлүгүн жокко чыгара албайбыз. Андан тышкары, катышуучулардын чектелген үлгү көлөмү бизге буланын гетерогендүүлүгүндөгү жыныстык айырмачылыктарды изилдөөгө тоскоол болду, анткени буланын түрүнүн катышы эркектер менен аялдардын ортосунда ар кандай экени белгилүү. Андан тышкары, биз бир эле булчуң талчаларында же бир эле катышуучулардын үлгүлөрүндө транскриптомикалык жана протеомикалык анализдерди жүргүзө алган жокпуз. Биз жана башкалар өтө төмөн үлгү киргизүүгө жетүү үчүн омикс анализин колдонуу менен бир клеткалуу жана бир миофиберлүү анализдерди оптималдаштырууну улантып жаткандыктан (митохондриялык миопатиясы бар бейтаптардын булаларын анализдөөдө көрсөтүлгөндөй), бир булчуң булаларынын ичинде мультиомикстүү (жана функционалдык) ыкмаларды айкалыштыруу мүмкүнчүлүгү айкын болуп калат.
Жалпысынан алганда, биздин маалыматтар скелет булчуңдарынын гетерогендүүлүгүнүн транскрипциялык жана транскрипциядан кийинки кыймылдаткычтарын аныктайт жана түшүндүрөт. Тактап айтканда, биз була түрлөрүнүн классикалык MYH негизиндеги аныктамасы менен байланышкан скелет булчуңдарынын физиологиясындагы көптөн бери келе жаткан догмага каршы чыккан маалыматтарды сунуштайбыз. Биз талкууну жаңыртып, акырында скелет булчуңдарынын классификациясы жана гетерогендүүлүгү жөнүндөгү түшүнүгүбүздү кайра карап чыгууну үмүттөнөбүз.
Он төрт ак терилүү катышуучу (12 эркек жана 2 аял) бул изилдөөгө катышууга өз ыктыяры менен макул болушту. Изилдөө Гент университетинин ооруканасынын (BC-10237) этика комитети тарабынан бекитилип, 2013-жылдагы Хельсинки декларациясына ылайык келген жана ClinicalTrials.gov сайтында (NCT05131555) катталган. Катышуучулардын жалпы мүнөздөмөлөрү 1-кошумча таблицада келтирилген. Оозеки жана жазуу жүзүндөгү маалыматтуу макулдук алынгандан кийин, катышуучулар изилдөөгө акыркы жолу кошулуудан мурун медициналык кароодон өтүшкөн. Катышуучулар жаш (22–42 жаш), дени сак (эч кандай медициналык абалы жок, тамеки чегүү тарыхы жок) жана орточо физикалык активдүү болушкан. Максималдуу кычкылтек сиңирүү мурда сүрөттөлгөндөй, физикалык даярдыкты баалоо үчүн кадамдык эргометрди колдонуу менен аныкталган. 81
Булчуң биопсиясынын үлгүлөрү эс алуу учурунда жана ачка абалда үч жолу, 14 күн аралык менен чогултулган. Бул үлгүлөр чоңураак изилдөөнүн алкагында чогултулгандыктан, катышуучулар биопсиядан 40 мүнөт мурун плацебо (лактоза), H1-рецепторунун антагонистин (540 мг фексофенадин) же H2-рецепторунун антагонистин (40 мг фамотидин) колдонушкан. Биз мурда бул гистамин рецепторунун антагонисттери эс алуудагы скелет булчуңдарынын фитнесине таасир этпей турганын көрсөткөнбүз81 жана биздин сапатты көзөмөлдөө графиктерибизде абалга байланыштуу кластерлер байкалган эмес (3 жана 6-кошумча сүрөттөр). Ар бир эксперимент күнүнөн 48 саат мурун стандартташтырылган диета (дене салмагына 41,4 ккал/кг, дене салмагына 5,1 г/кг углевод, дене салмагына 1,4 г/кг белок жана дене салмагына 1,6 г/кг май) сакталган, ал эми эксперимент күнүнүн эртең менен стандартташтырылган эртең мененки тамак (дене салмагына 1,5 г/кг углевод) ичилген. Жергиликтүү анестезия астында (адреналинсиз 0,5 мл 1% лидокаин), булчуң биопсиялары тери аркылуу Бергстрём аспирациясын колдонуу менен vastus lateralis булчуңунан алынган.82 Булчуң үлгүлөрү дароо РНКга салынып, андан кийин кол менен буланы бөлүп алганга чейин (3 күнгө чейин) 4°C температурада сакталган.
Жаңы бөлүнүп алынган миофибер түйүндөрү өстүрүүчү идиштеги жаңы РНК-латер чөйрөсүнө которулган. Андан кийин жеке миофиберлер стереомикроскоп жана майда пинцет менен кол менен кесилген. Ар бир биопсиядан жыйырма беш була кесилген, биопсиянын ар кайсы аймактарынан булаларды тандоого өзгөчө көңүл бурулган. Бөлүп алгандан кийин, ар бир була керексиз белокторду жана ДНКны алып салуу үчүн протеиназа К жана ДНК ферменттерин камтыган 3 мкл лизис буферине (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) акырын чөмүлтүлгөн. Андан кийин клетка лизиси жана белок/ДНКны алып салуу кыскача вортекстөө, суюктукту микроцентрифугада айландыруу жана бөлмө температурасында (10 мүнөт) инкубациялоо аркылуу башталган. Андан кийин лизат термикалык циклерде (T100, Bio-Rad) 37°C температурада 5 мүнөт, 75°C температурада 5 мүнөт инкубацияланган жана андан кийин андан ары иштетилгенге чейин дароо -80°C температурада сакталган.
Illumina менен шайкеш келген полиаденилденген РНК китепканалары 2 мкл миофибер лизатынан QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) колдонуу менен даярдалган. Толук ыкмаларды өндүрүүчүнүн колдонмосунан тапса болот. Процесс тескери транскрипция аркылуу биринчи жиптүү кДНК синтезинен башталат, анын жүрүшүндө үлгүлөрдүн топтолушун камсыз кылуу жана кийинки иштетүү учурунда техникалык өзгөрмөлүүлүктү азайтуу үчүн уникалдуу молекулярдык идентификаторлор (UMI) жана үлгүгө мүнөздүү i1 штрих-коддору киргизилет. Андан кийин 96 миофиберден алынган кДНК бириктирилип, магниттик мончоктор менен тазаланат, андан кийин РНК алынып салынат жана кокустук праймерлерди колдонуу менен экинчи жиптүү синтез жүргүзүлөт. Китепкана магниттик мончоктор менен тазаланат, пулга мүнөздүү i5/i7 тегдери кошулат жана ПЦР күчөтүлөт. Акыркы тазалоо кадамы Illumina менен шайкеш келген китепканаларды түзөт. Ар бир китепкана пулунун сапаты жогорку сезгичтиктеги кичинекей фрагменттүү ДНК анализ комплекти (Agilent Technologies, DNF-477-0500) аркылуу бааланган.
Qubit сандык аныктоосунун негизинде, пулдар эквимолярдык концентрацияларда (2 нМ) андан ары топтолду. Андан кийин алынган пул NovaSeq 6000 инструментинде стандарттуу режимде NovaSeq S2 реагент комплектин (1 × 100 нуклеотид) 2 нМ жүктөм менен (4% PhiX) секвенирленген.
Биздин түтүк Lexogen'дин QuantSeq Pool маалыматтарды талдоо түтүгүнө негизделген (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Маалыматтар алгач i7/i5 индексинин негизинде bcl2fastq2 (v2.20.0) менен демультиплекстелген. Андан кийин 2-окуу i1 үлгү штрих-кодунун негизинде idemux (v0.1.6) менен демультиплекстелген жана UMI ырааттуулуктары umi_tools (v1.0.1) менен алынган. Андан кийин окуулар cutadapt (v3.4) менен бир нече раундда кыскартылып, кыска окууларды (<20 узундуктагы) же адаптер ырааттуулуктарынан гана турган окууларды алып салынган. Андан кийин окуулар STAR (v2.6.0c) аркылуу адам геномуна тегизделген жана BAM файлдары SAMtools (v1.11) менен индекстелген. Кайталанган окуулар umi_tools (v1.0.1) аркылуу алынып салынган. Акырында, тегиздөөнү эсептөө Subread'теги featureCounts аркылуу жүргүзүлдү (v2.0.3). Сапатты көзөмөлдөө куурдун бир нече аралык этаптарында FastQC (v0.11.9) колдонуу менен жүргүзүлдү.
Андан аркы биоинформатиканы иштетүү жана визуалдаштыруу R (v4.2.3) тилинде, негизинен Seurat (v4.4.0) жумуш агымын колдонуу менен жүргүзүлдү. 83 Ошондуктан, жеке UMI маанилери жана метадайындар матрицалары Seurat объектилерине айландырылды. Бардык булалардын 30% дан азында экспрессияланган гендер алынып салынды. Сапатсыз үлгүлөр 1000 UMI маанилеринин жана 1000 аныкталган гендин минималдуу босогосунун негизинде алынып салынды. Акыр-аягы, 925 була бардык сапатты көзөмөлдөө чыпкалоо кадамдарынан өттү. UMI маанилери Seurat SCTransform v2 ыкмасын колдонуу менен нормалдаштырылды, 84 аныкталган бардык 7418 өзгөчөлүктү камтыйт жана катышуучулардын ортосундагы айырмачылыктар регрессияланды. Бардык тиешелүү метадайындарды 28-кошумча маалыматтар топтомунан тапса болот.